Imunoprecipitacija

Imunoprecipitacija (IP) je tehnika taloženja proteinskih antigena iz rastvora pomoću antitijela koje se specifično vezuje na određeni protein. Ovaj proces može se koristiti za izolaciju i koncentriranje određenog proteina iz uzorka koji sadrži hiljade različitih proteina. Imunoprecipitacija zahtijeva da se antitijelo spoji na čvrsti supstrat u nekom trenutku postupka.

Tipovi

Individualna proteinska imunoprecipitacija (IP)

Uključuje korištenje antitijela koje je specifično za poznati protein za izolaciju tog određenog proteina iz rastvora koji sadrži mnogo različitih proteina. Ovi rastvori će često biti u obliku sirovog lizata biljnog ili životinjskog tkiva. Drugi tipovi uzoraka mogu biti tjelesne tečnosti ili drugi uzorci biološkog porijekla.

Imunoprecipitacija proteinskog kompleksa (Co-IP)

Imunoprecipitacija intaktnih proteinskih kompleksa (tj. antigena zajedno sa bilo kojim proteinima ili ligandima koji su vezani za njega) poznata je kao koimunoprecipitacija (Co-IP). Co-IP djeluje tako što odabire antitijelo koje cilja na poznati protein za koji se vjeruje da je član većeg proteinskog kompleksa. Ciljanjem ovog poznatog člana s antitijelom može postati moguće izvući cijeli proteinski kompleks iz rastvora i na taj način identificirati nepoznate članove kompleksa.

Ovo funkcionira kada se proteini uključeni u kompleks čvrsto vežu jedni za druge, što omogućava da se više članova kompleksa izvuče iz otopine tako što se zakače za jedaog člana s antitijelom. Ovaj koncept ekstrakcije proteinskih kompleksa iz rastvora ponekad se naziva "povlačenjem prema dolje". Co-IP je moćna tehnika koja se u molekulskoj biologiji redovno koristi za analizu interakcija protein-proteini.

• Određeno antitijelo često bira subpopulaciju svog ciljnog proteina koji ima izložen epitop, čime ne uspijeva da identifikuje bilo koji protein u kompleksima koji skrivaju epitop. To se može vidjeti u tome da je rijetko moguće istaložiti čak i polovinu datog proteina iz uzorka s jednim antitijelom, čak i kada se koristi veliki višak antitijela.
• Kako se odvijaju uzastopni krugovi ciljanja i imunoprecipitacije, broj identificiranih proteina može nastaviti rasti. Identificirani proteini možda nikada neće postojati u jednom kompleksu u datom trenutku, ali umjesto toga mogu predstavljati mrežu proteina koji međusobno djeluju u različito vrijeme u različite svrhe.
• Ponavljanje eksperimenta ciljanjem na različite članove proteinskog kompleksa omogućava da se još jednom provjeri rezultat. Svaki krug taloženja trebao bi rezultirati oporavkom, kako originalnog poznatog proteina, tako i drugih prethodno identificiranih članova kompleksa (pa čak i novih dodatnih članova). Ponavljajući imunoprecipitaciju na ovaj način, potvrđuje se da je svaki identificirani član proteinskog kompleksa bio valjana identifikacija. Ako se određeni protein može povratiti samo ciljanjem na jedan od poznatih članova, ali ne i ciljanjem na druge poznate članove, tada status tog proteina kao člana kompleksa može biti upitan.

Hromatinska imunoprecipitacija (ChIP)

Radni tok čipovanog sekvenciranja

Hromatinska imunoprecipitacija (ChIP) je metod koji se koristi za određivanje lokacije mjesta vezanja DNK na genomu za određeni proteina od interesa. Ova tehnika daje sliku interakcija protein-DNK koje se dešavaju unutar jedra živih ćelija ili tkiva. In vivo priroda ovog metoda je u suprotnosti s drugim pristupima koji se tradicionalno koriste da bi se odgovorilo na ista pitanja.

Princip koji podupire ovaj test je da proteini koji se vezuju za DNK (uključujući transkripcijske faktore i histone) u živim ćelijama mogu biti povezani za DNK za koju se vezuju. Korištenjem antitijela koje je specifično za navodni protein koji se vezuje za DNK, može se imunoprecipitirati kompleks protein-DNK iz ćelijskih lizata. Umrežavanje DNK postiže se često primjenom formaldehida na ćelije (ili tkivo), iako je ponekad korisno koristiti definiranije i konzistentnije umreženo sredstvo kao što je dimetil 3,3′-ditiobispropionimidat -2 HCl (DTBP). Nakon umrežavanja, ćelije se liziraju i DNK se sonifikacija|sonifikacijom]] razbije na komade dužine 0,2–1,0 kb. Tada se izvodi imunoprecipitacija koja rezultira pročišćavanjem kompleksa protein-DNK. Pročišćeni kompleksi protein-DNK se zatim zagrijavaju, kako bi se preokrenulo formaldehidno umrežavanje proteina i DNK kompleksa, omogućavajući da se DNK odvoji od proteina. Identitet i količina izolovanih fragmenata DNK se tada može odrediti lančanom reakcijom polimeraze (PCR). Ograničenje izvođenja PCR-a na izolovanim fragmentima je to što se mora imati ideja koja genomska regija je ciljana da bi se generirali ispravni PCR prajmeri. Ponekad se ovo ograničenje zaobilazi jednostavnim kloniranjem izolovane genomske DNK u plazmidni vektor, a zatim upotrebom prajmera koji su specifični za regiju kloniranja tog vektora. Alternativno, kada se želi pronaći gdje se protein vezuje na nivou genoma, koristi se ChIP-sekvenca i nedavno se pojavila kao standardna tehnologija koja može lokalizirati mjesta vezanja proteina u visokopropusnim , isplativim načinima, koji također omogućavaju karakterizaciju cistrona. Ranije se takođe koristili DNK mikročipovi.

RNP imunoprecipitacija (RIP)

Slično gore navedenoj imunoprecipitaciji hromatina (ChIP), ali umjesto da cilja na proteine koji vezuju DNK kao u ChIP, RNP imunoprecipitacija cilja ribonukleoproteine (RNP-ove). Žive ćelije se prvo liziraju (razgrade), a zatim se ciljni protein i povezana RNK imunoprecipitiraju upotrebom antitijela koje cilja protein od interesa. Prečišćeni RNK-proteinski kompleksi mogu se odvojiti izvođenjem ekstrakcije RNk, a identitet RNK se može odrediti cDNK sekvenciranjeM. ili PUTEM RT-PCR. Neke varijante RIP-a, kao što je PAR-CLIP, uključuju korake umrežaVanja, koji onda zahtijevaju manje pažljive uslove lize.

Označeni proteini

Povucite test koristeći označene proteine

Jedna od glavnih tehničkih prepreka kod imunoprecipitacije je velika poteškoća u stvaranju antitijela koje specifično cilja jedan poznati protein. Kako bi zaobišle ovu prepreku, mnoge grupe će konstruirati tagove na C– ili N-terminalnom kraju proteina od interesa. Prednost ovdje je u tome što se ista oznaka/tag može uvijek iznova koristiti na mnogo različitih proteina i istraživač svaki put može koristiti isto antitijelo. Prednosti upotrebe označenih proteina su toliko velike da je ova tehnika postala uobičajena za sve tipove imunoprecipitacije uključujući sve tipove IP-a koji su detaljno opisani gore. Primjeri oznaka koje se koriste su oznaka zeleni fluorescentni proteini (GFP), tag glutation-S-transferaza (GST) i oznaka FLAG-tag. Iako je upotreba oznake za omogućavanje padajućeg menija zgodna, izaziva zabrinutost u vezi sa biološkom relevantnošću jer sama oznaka može ili prikriti prirodne interakcije ili uvesti nove i neprirodne interakcije.

Protokol

Nakon što je odabrana tehnologija perli od čvrstog supstrata, antitijela se spajaju na kuglice i kuglice obložene antitijelima se mogu dodati u heterogeni proteinski uzorak (npr. homogenizirano tkivo). U ovom trenutku, antitijela koja su imobilizirana na kuglice će se vezati za proteine koje specifično prepoznaju. Jednom kada se to dogodi, dio protokola za imunoprecipitaciju je zapravo gotov, jer su specifični proteini od interesa vezani za antitijela koja su sama imobilizirana za kuglice. Odvajanje imunokompleksa iz lizata je izuzetno važan niz koraka, jer protein(i) moraju ostati vezani jedan za drugog (u slučaju ko-IP) i vezani za antitijelo tokom koraka ispiranja kako bi se uklonili nevezani proteina i smanjuju pozadinu.

Kada se radi sa kuglicama agaroze, zrnca se moraju peletirati iz uzorka, kratkim okretanjem u centrifugi sa silama između 600-3.000 x g (puta standardne gravitacijske sile). Ovaj korak može se izvesti u standardnoj epruveti za mikrocentrifugu, ali radi bržeg odvajanja, veće konzistencije i većeg izvlačenja, proces se često izvodi u malim centrifugalnim kolonama s veličinom pora koja omogućava prolazak tekućine, ali ne i zrnca agaroze. Nakon centrifugiranja, kuglice agaroze će formirati vrlo labavu pahuljastu kuglicu na dnu epruvete. Supernatant koji sadrži kontaminante može se pažljivo ukloniti kako se ne bi ometale perle. Pufer za ispiranje se zatim može dodati kuglicama i nakon miješanja, kuglice se ponovo odvajaju centrifugiranjem.

Kod superparamagnetnih perli, uzorak se stavlja u magnetno polje tako da se kuglice mogu skupljati na strani cijevi. Ova procedura je uglavnom završena za otprilike 30 sekundi, a preostala (neželjena) tečnost se pipetira. Ispiranje se postiže resuspendiranjem kuglica (sa magneta) otopinom za pranje, a zatim koncentriranjem kuglica natrag na zid cijevi (postavljanjem cijevi nazad na magnet). Pranje se obično ponavlja nekoliko puta, kako bi se osiguralo adekvatno uklanjanje zagađivača. Ako su superparamagnetne perle homogene veličine i magnet je pravilno dizajniran, perle će se ravnomjerno koncentrirati na strani cijevi i otopina za pranje može se lahko i potpuno ukloniti.

Nakon ispiranja, istaloženi protein(i) se eluiraju i analiziraju pomoću gel elektroforeza, masene spektrometrije, Western blottinga ili bilo kojeg broja drugih metoda za identifikaciju sastojaka u kompleksu. Vremena protokola za imunoprecipitaciju uveliko variraju zbog različitih faktora, pri čemu se vrijeme protokola povećava s brojem potrebnih ispiranja ili sa sporijom kinetikom reakcije poroznih zrnaca agaroze.

Koraci

1. Lizirajte ćelije i pripremite uzorak za imunoprecipitaciju.
2. Prethodno očistite uzorak tako što ćete uzorak proći preko perlica samih ili vezanih za irelevantno antitijelo kako bi se upijali svi proteini koji se nespecifično vezuju za IP komponente.
3. Inkubirajte rastvor sa antitelom protiv proteina od interesa. Antitijelo se može pričvrstiti na čvrsti nosač prije ovog koraka (direktna metoda) ili nakon ovog koraka (indirektna metoda). Nastavite inkubaciju kako biste omogućili formiranje kompleksa antitijelo-antigen.
4. Precipitirajte kompleks od interesa, uklanjajući ga iz rasutog rastvora.
5. Operite precipitirani kompleks nekoliko puta. Okrenite svaki put između pranja kada koristite kuglice agaroze ili postavite epruvetu na magnet kada koristite superparamagnetne perle, a zatim uklonite supernatant. Nakon završnog pranja, uklonite što je moguće više supernatanta.
6. Eluirati proteine iz čvrstog nosača koristeći pufer za punjenje uzoraka niskog pH ili SDS.
7. Analizirajte komplekse ili antigene od interesa. To se može učiniti na različite načine:
   1. SDS-PAGE (natrij-dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeza) nakon čega slijedi bojenje gelom.
   2. SDS-PAGE praćeno: bojenjem gela, izrezivanjem pojedinačnih obojenih proteinskih traka i sekvenciranjem proteina u trakama matričnom potpomognutom laserskom desorpcijom/ionizacijom (MALDI) masenom spektrometrijom.
   3. Transfer i Western blota korištenjem drugog antitela za proteine koji su bili u interakciji sa antigenom, nakon čega sledi detekcija pomoću hemiluminescencija ili fluorescencije sekundarnog antitela.

Vanjski linkovi

• Analysis of Proteins Using Immunoprecipitation at ufl.edu
• Immunoprecipitation na US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
• Chromatin immunoprecipitation na US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
• Introduction to Immunoprecipitation Methodology