Proteinske metode

Proteinski metodi su tehnike koje se koriste za proučavanje protein. Postoje eksperimentalne metode za proučavanje proteina (npr. za detekciju proteina, za izolaciju i pročišćavanje proteina i za karakterizaciju strukture i funkcije proteina, često zahtijevajući da se protein prvo pročisti). Računarske metode obično koriste kompjuterske programe za analizu proteina. Međutim, mnoge eksperimentalne metode (npr. masena spektrometrija) zahtijevaju računsku analizu sirovih podataka.

Genetički metodi

Eksperimentalna analiza proteina obično zahtijeva ekspresiju i pročišćavanje proteina. Ekspresija se postiže manipulacijom DNK koja kodira protein(e) od interesa. Dakle, analiza proteina obično zahtijeva DNK metode, posebno kloniranje. Neki primjeri genetičkih metoda uključuju konceptualno prevođenje, sajt-usmjerenu mutagenezu, korištenje fuzijskog proteina i podudaranje alela sa stanjima bolesti. Neki proteini nikada nisu direktno sekvencirani, ali prevođenjem kodona iz poznatih sekvenci iRNK u aminokiseline, metodom poznatom kao konceptna translacija. (Pogledajte genetički kod.) Mutageneza usmjerena na mjesto selektivno uvodi mutacije koje mijenjaju strukturu proteina. Funkcija dijelova proteina može se bolje razumjeti proučavanjem promjene fenotipa kao rezultat ove promjene. Fuzijski proteini se prave umetanjem proteinskih oznaka, kao što je His-tag, kako bi se proizveo modificirani protein koji je lakše pratiti. Primjer za to bi bio GFP-Snf2H koji se sastoji od proteina vezanog za zeleni fluorescentni protein kako bi se formirao hibridni protein. Analizom DNK alela mogu se identifikovati kao povezani sa bolesnim stanjima, kao što je u izračunavanje LOD rezultata.

Ekstrakcija proteina iz tkiva

Ekstrakcija proteina iz tkiva sa čvrstim vanćelijskim matriksom (npr. uzorci biopsije, venskatkiva, hrskavica, koža) se često postiže u laboratorijskim uslovima udarnim prahom u tečnom dušiku. Uzorci se zamrzavaju u tekućem dušiku i potom podvrgavaju udarcima ili mehaničkom mljevenju. Kako voda u uzorcima na ovoj temperaturi postaje vrlo krhka, uzorci se često svode na zbirku finih fragmenata, koji se zatim mogu otopiti za ekstrakciju proteina. U tu svrhu se ponekad koriste uređaji od nehrđajućeg čelika, poznati kao drobilice tkiva. Prednosti ovih uređaja uključuju visok nivo ekstrakcije proteina iz malih, vrijednih uzoraka, nedostaci uključuju nizak nivo unakrsne kontaminacije.

Prečišćavanje proteina

• Izolacija proteina
  • Metodi hromatografije: ionska izmjena, hromatografija za isključivanje po veličini (ili gel filtracija), afinitetna hromatografija
• Ekstrakcija i solubilizacija proteina
• Koncentrovanje proteinskih rastvora
• Gel-elektroforeza
  • Gel elektroforeza u uslovima denaturacije
  • Gel elektroforeza u nedenaturirajućim uslovima
  • 2D gel elektroforeza
• Elektrofokusiranje

Otkrivanje proteina

Prilično mala veličina proteinskih makromolekula čini identifikaciju i kvantifikaciju nepoznatih uzoraka proteina posebno teškim. Razvijeno je nekoliko pouzdanih metoda za kvantifikaciju proteina kako bi se proces pojednostavio. Ove metode uključuju Warburg-Christianov metod, Lowryjev test i Bradfordov test (svi se oslanjaju na svojstva apsorpcije makromolekula). Bradfordov metod analize koristi boju da se veže za protein. Najčešće se koristi Coomassie brilliant blue G-250 bojau. Kada nema proteina, boja je crvena, ali kada se veže za protein postaje plava. Kompleks boja-protein maksimalno apsorbuje svetlost na talasnoj dužini 595 nanometara i osetljiv je na uzorke koji sadrže od 1 ug do 60 ug. Za razliku od Lowryjevog i Warburg-Christianog metoda, Bradfordovi testovi se ne oslanjaju na sadržaj triptofana i tirozina u proteinima, što omogućava da metod bude hipotetski precizniji.

Lowryjev test je sličan biuretskim testovima, ali koristi Folinski reagens koji je precizniji za kvantifikaciju. Folin reagens je stabilan samo u kiselim uslovima i metod je podložan iskrivljenim rezultatima u zavisnosti od toga koliko je triptofana i tirozina prisutno u ispitivanom proteinu. Folinski reagens se veže za triptofan i tirozin, što znači da koncentracija dvije aminokiseline utiče na osjetljivost metoda. Metod je osjetljiv u rasponima koncentracija sličnim Bradfordovom metodu, ali zahtijeva neznatnu količinu više proteina.

Warburg-Christianov metod provjerava proteine u njihovim prirodnim rasponima apsorpcije. Većina proteina vrlo dobro apsorbira svjetlost na 280 nanometara, zbog prisustva triptofana i tirozina, ali je osjetljiv na različite količine aminokiselina na koje se oslanja.

Više metoda je navedeno ispod koje se povezuju sa detaljnijim računima za njihove primjene.

Nespecifične metode koje otkrivaju samo ukupne proteine

• Apsorbanca: očitavanje na 280 ili 215 nm. Može biti veoma netačno. Detekcija u rasponu od 100 μg/mL do 1 mg/mL. Omjer očitavanja apsorbancije uzet na 260/280 može ukazivati na čistoću/kontaminaciju uzorka (čisti uzorci imaju omjer <0,8)
• Bradfordov proteinski test: Detekcija u rasponu od ~1 mg/mL
• Testovi izvedeni iz biureta:
  • test bicinhoninske kiseline (BCA test): Detekcija do 0,5 μg/mL
  • Lowryjev test proteina: detekcija u rasponu od 0,01–1,0 mg/mL
• Fluoreskamin: Kvantifikuje proteine i peptide u rastvoru ako je primarni amin prisutan u aminokiselinama
• Amido black: Detekcija u rasponu od 1-12 μg/mL
• Koloidno zlato: Detekcija u rasponu od 20 - 640 ng/mL
• Azot detekcija:
  • Kjeldahlov metod: koristi se prvenstveno za hranu i zahtijeva oksidaciju materijala
  • Dumas metoda: koristi se prvenstveno za hranu i zahtijeva sagorijevanje materijala

Specifični metodi otkrivanja količine jednog proteina

• Metodi spektrometrije:
  • Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC): Metod hromatografije za otkrivanje proteina ili peptida
  • Tečna hromatografija–masena spektrometrija (LC/MS): Može detektovati proteine u niskim koncentracijama (ng/mL do pg/mL) u krvi i telesnim tečnostima, kao što je farmakokinetika.
• Antitijelo ovisni metodi:
  • Enzimski imunosorbentni test (ELISA): može posebno otkriti proteine do pg/mL.
  • Proteinska imunoprecipitacija: tehnika precipitacije proteinskog antigena iz rastvora korišćenjem antitela koje se specifično vezuje za taj određeni protein.
  • Imunoelektroforeza: odvajanje i karakterizacija proteina na osnovu elektroforeze i reakcije sa antitijelima.
  • Western blot: uparuje elektroforezu u gelu i inkubaciju s antitijelima za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku homogenata ili ekstrakta tkiva (tip tehnike imunoelektroforeza).
  • Imunobojenje proteina

Proteinske strukture

• Rentgenska kristalografija
• Proteinski NMR
• Krioelektronska mikroskopija
• Raspršenje X-zraka pod malim uglom
• Cirkurarni dihroizam

Interakcije koje uključuju proteine

• Proteinski otisak

Interakcije protein-protein

• (kvaščev) dvohibridni sistem
• Test komplementacije proteinskih fragmenata
• Koimunoprecipitacija
• Afinitetno prečišćavanje i masena spektrometrija
• Test blizine ligacije
• Označavanje blizine

Interakcije protein-DNK

• ChIP-on-chip
• Čip-sekvenciranje
• DamID
• Termoforeza mikrorazmjera

Interakcije protein-RNK

• Test otiska prsta
• TCP-seq

Računarski metodi

• Molekularna dinamika
• Predviđanje strukture proteina
• Poravnavanje proteinske sekvence (poređenje sekvence, uključujući BLAST)
• Strukturno poravnanje proteina
• Ontologija proteina (vidi ontologija gena)

Ostali metodi

• Izmjena vodika i deuterija
• Masena spektrometrija
• Sekvenciranje proteina
• Sinteza proteina
• Proteomika
• Peptidni masovni otisak
• Test vezivanja liganda
• Eastern blotting
• Metaboličko označavanje
  • Označavanje teških izotopa
  • Označavanje radioaktivnih izotopa

Također pogledajte

• CSH protokoli
• Sadašnji protokoli

Bibliografija

• Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki and Stuart J. Edelstein. (1996.) Protein Methods, 2 ed., Wiley Publishers. ISBN 0-471-11837-0.