Splicing

O termo inglés splicing utilízase internacionalmente para referirse ao que tamén se denomina empalme. Trátase do empalme de fragmentos cortados dunha molécula, que se volven a unir cataliticamente, xeralmente eliminando algúns deles. O termo úsase fundamentalmente para referirse aos procesos que teñen lugar durante a maduración do ARN, pero pode falarse de splicing nos seguintes tres casos:

Splicing de ARN: É un proceso co-transcricional de corte e empalme de ARN. O ARN córtase en cachos, elimínanse algúns deles e empálmanse os demais, orixinando o ARN maduro. Este proceso é moi común en eucariotas, nos que se dá en calquera tipo de ARN aínda que é máis común no ARNm. Tamén se describiu no ARNr e ARNt de procariotas e virus bacteriófagos.
Splicing de proteínas: É un proceso postraducional de corte e empalme dunha proteína precursora. Este proceso comporta a eliminación dunha secuencia de aminoácidos da cadea polipeptídica para despois unir o resto e orixinar unha proteína madura máis pequena.
Splicing de ADN^[1]: Proceso que consiste na unión covalente de dous fragmentos de ADN bicatenario, catalizado por unha ADN ligase.

Splicing de ARN

O splicing de ARN ou empalme de ARN é un proceso post-transcricional de corte e empalme de ARN. Normalmente consiste en cortar o ARN, eliminar os intróns do transcrito primario e posteriormente unir os exóns; aínda que hai casos nos que se eliminan tamén exóns ou se conservan intróns (splicing alternativo). É un proceso habitual en todos os tipos de ARN de eucariotas, especialmente no ARNm, pero tamén se pode dar en ARNr e ARNt de procariotas e bacteriófagos.

Intróns espliceosomais

Os intróns espliceosomais atópanse en xenes eucarióticos que codifican proteínas. Nun destes intróns atopamos tres sitios requiridos para o splicing, que son: o sitio doante de empalme 3', o sitio aceptor de empalme 5', e o sitio de ramificación (preto do 3' do intrón). O sitio de empalme do extremo 5' do intrón ten unha secuencia constante GU, situada dentro dunha rexión de consenso máis grande e menos conservada. O sitio de empalme 3' ou sitio aceptor remata coa secuencia invariante AG. Desde esta zona en dirección 5' hai unha rexión rica en pirimidinas (C e U). Seguindo en dirección 5' desde esta rexión está o punto de ramificación, que inclúe unha adenina, implicada na formación do lazo (lariat).^[2]^[3] Mutacións puntuais no ADN ou erros durante a transcrición poden activar un "sitio de empalme oculto" ou críptico en parte do transcrito que xeralmente non é cortado. Isto orixina un ARNm maduro ao que lle falta unha sección dun exón. Deste modo, unha mutación puntual, que normalmente só afectaría a un só aminoácido, pode manifestarse como unha deleción no final da proteína.

Partes dun intrón spliceosomal. 1-sitio de empalme 3'. 2-zona rica en pirimidinas. 3-punto de ramificación. 4-sitio de empalme 5'.

Métodos de splicing de ARN

Na natureza existen diversos métodos de splicing do ARN. O mecanismo de splicing depende da estrutura do fragmento de ARN que pasará por este proceso, tendo en conta os seus tipos de intróns e o tipo de catálise requirida. Distinguiremos as seguintes vías de splicing:

Espliceosoma

O espliceosoma ou complexo de empalme é un complexo encargado de realizar o splicing formado por cinco ribonucleoproteínas nucleares pequenas ou snRNP e varios factores proteicos. O compoñente de ARN das snRNP é o encargado de recoñecer o intrón. A maior parte das interaccións entre o ARN inmaturo e as snRNP supoñen emparellamentos de bases entre porcións de secuencias nucleotídicas complementarias. Por exemplo, o ARN nuclear pequeno U1 do espliceosoma contén unha secuencia complementaria da secuencia consenso atopada na unión exón-intrón en 5', o que lle permite unirse a esta rexión dos pre-ARNm. Do mesmo xeito hai emparellamentos de bases entre as diferentes snRNP.

Identificáronse dous tipos de espliceosomas, o maior e o menor, e cada un contén diferentes tipos de snRNP.

Espliceosoma maior

Ensamblaxe do espliceosoma e eliminación dun intrón. As barras gordas azuis son exóns, e a liña fina negra é o intrón a eliminar.

Está formado polas snRNP U1, U2, U4, U5 e U6, está activo no núcleo e require para a súa ensamblaxe doutras proteínas como a U2AF e SF1 ^[3]^[4]. Recoñece a secuencia consenso GU (guanina-uracilo) do extremo 5' do intrón así como a secuencia consenso AG do extremo 3'. O 99% dos intróns elimínanse a través deste mecanismo.

Os compoñentes do espliceosoma vanse ensamblando seguindo unha orde na que se van formando os seguintes complexos:

Complexo E: A snRNP U1 únese á secuencia consenso GU do extremo 5’ do sitio de empalme do intrón, xunto coas proteínas accesorias ASF/SF2, U2AF, SF1/BBP.
Complexo A: U2 únese ao sitio de ramificación e hidroliza ATP. O sitio de ramificación está situado a unha distancia de 20-40 nucleótidos do extremo 3’ do intrón e nel localízase a secuencia consenso CURAY.
Complexo B1: O complexo trímero formado por U5, U4 e U6 sitúase no intrón. Colócase de modo que U5 está unido ao exón do extremo 5’, e U6 a U2.
Complexo B2: Libérase U1. U5 pasa do exón ao intrón, e U6 únese ao sitio de empalme do extremo 5’.
Complexo C1: Libérase U4. U5 únese ao sito de empalme do exón do extremo 3'. U6 e U2 catalizan a reacción de transesterificación, que fai que unha vez cortado o extremo 5' do intrón, se ligue na A do intrón do sitio de ramificación, e como resultado fórmase unha estrutura en bucle característica denominada lazo ou lariat. U5 únese ao sitio de corte do exón do extremo 3'.
Complexo C2: U2/U5/U6 permanecen unidos ao lariat (lazo), que xa só está unido ao exón 3'. Córtase agora sitio 3’, o que provoca a liberación do lazo de ARN co espliceosoma unido a el. A continuación líganse os dous exóns, o que comporta gasto de ATP. Por último, o complexo espliceosoma disóciase e o intrón (o lazo), ábrese e degrádase. Deste modo, os dous exóns quedaron unidos e o intrón que estaba en medio foi eliminado.

Espliceosoma menor

É similar ao maior e tamén nuclear, pero o seu uso é máis raro e está reservado para eliminar intróns con diferenzas nos sitios de corte e empalme con respecto ao normal. Tamén se diferencian nas secuencias consenso recoñecidas, que neste caso son AU e AC para os extremos 3’ e 5’, respectivamente. Ademais, agás a partícula snRNP U5, o resto son análogos funcionais denominadas U11 (análogo funcional da U1), U12 (da U2), U4atac (da U4) e U6atac (daU6)^[5].

Trans-splicing

Consiste no empalme de exóns de dous transcritos primarios distintos, coa conseguinte formación dun ARN híbrido mediada polo espliceosoma. A diferenza deste, o splicing normal (ou cis-splicing) actúa sobre unha soa molécula de ARN en lugar de sobre transcritos distintos. O trans-splicing é pouco común ^[6].

Auto-splicing

É un corte e empalme no que o propio intrón actúa como catalizador da súa eliminación, polo que non se require a actuación de proteínas. Cando un fragmento de ARN ten actividade catalítica denomínase ribozima. Para que o mecanismo de auto-splicing sexa preciso requírese hidrólise de ATP. Existen dous tipos de intróns que actúan como ribozimas, os intróns do grupo I e os do grupo II. A semellanza no mecanismo de corte e empalme destes intróns e do espliceosoma suxiren que probablemente evolucionaron xuntos aínda que tamén se propuxo que o auto-splicing apareceu durante as primeiras fases da orixe da vida no chamado mundo de ARN.

Intróns do grupo I

O grupo OH 3’ que pode ser da ribosa dun nucleósido libre de guanina ou dunha guanosina do propio intrón ou dun cofactor (GMP, GDP ou GTP), ataca ao fosfato do sitio de empalme 5’. O que dá lugar ao corte do intrón polo seu extremo 5’ e á formación do lazo lariat.
El grupo OH 3’ do exón leva a cabo un ataque nucleofílico contra o extremo 3’ do intrón, o que orixina o seu corte e a liberación da estrutura en lazo.
Únense os exóns.

Intróns do grupo II

O grupo OH 2’ dunha adenosina específica do intrón ataca o sitio de empalme 5’, orixinando a estrutura en lazo (lariat).
O grupo OH 3’ do exón leva a cabo un ataque nucleofílico contra o extremo 3’ do intrón, o que orixina o seu corte e a liberación da estrutura en lazo.
Únense os exóns.

Splicing de ARNt

É un mecanismo de corte e empalme pouco usual que se observa en ARNt. O mecanismo involucra diferentes rutas bioquímicas como a esplceosomal e o auto-splicing.

Erros no splicing

As mutacións poden afectar aos sitios de splicing, o que pode influír sobre a síntese proteica de distintas formas:

Perda do sitio de splicing: pode orixinar a aparición prematura dun codón de parada, a perdida dun exón ou a inclusión dun intrón.
Reducir a especificidade: pode variar a localización do sitio de splicing, o que orixina a inserción ou deleción de aminoácidos ou a perda da pauta de lectura.
Transposición do sitio de splicing: orixina a inserción ou deleción de ARN, o que orixina cadeas de ARN máis curtas ou longas.

Splicing alternativo

O splicing alternativo ou empalme alternativo permite obter a partir dun só transcrito primario de ARN distintas moléculas de ARN maduras. Este proceso ocorre principalmente en eucariotas aínda que tamén pode observarse en virus. Basicamente consiste en cambiar a composición de exóns dos ARN definitivos formados. Poden omitirse exóns, empalmalos de diferente maneira, ou reter algún intrón.

Artigo principal: splicing alternativo.

Evolución

O splicing obsérvase en todos os dominios e reinos biolóxicos, pero a súa frecuencia e tipos varía moito duns grupos a outros. Os eucariotas utilízano para procesar moitos ARNm que codifican proteínas. Os procariotas raramente o utilizan e fano principalmente para procesar ARN non codificante. Outra importante diferenzas entre ambos os grupos é que os procariotas carecen por completo do mecanismo espliceosomal.

Como os intróns esplicoesomais non se conservan en todas as especies, hai un debate sobre o momento en que xurdiu o splicing espliceosomal. Propuxéronse dous modelos: o modelo dos intróns tardíos e o dos intróns temperáns (ver o apartado "Funcións biolóxicas e evolución" en "intrón").

**Diversidade de splicing**
	Eucariotas	Procariotas
Espliceosomal	+	-
Auto-splicing	+	+
ARNt	+	+

Splicing de proteínas

Nalgúns casos as proteínas tamén poden sufrir splicing.^[7] Os mecanismo biomoleculares son diferentes aos do splicing do ARN, pero tamén neste caso son eliminadas partes da molécula, que na proteína non se chaman intróns senón inteínas. As partes que quedan chámanse exteínas en vez de exóns, e únense formando a proteína definitiva. O splicing de proteínas observouse nunha ampla gama de organismos, como bacterias, arqueas, plantas, lévedos e tamén en humanos.^[8]

Splicing de ADN

Consiste na unión de fragmentos de ADN. Por exemplo, na técnica do splicing de ADN por ligazón dirixida (ou SDL, DNA splicing by directed ligation) utilízase a amplificación por PCR dun determinado conxunto de segmentos de ADN, endonucleases de restrición que crean extremos cohesivos nos produtos de amplificación e a ligazón final dos segmentos para dar a secuencia desexada.^[1]

Notas

↑ ^1,0 ^1,1 E N Lebedenko, K R Birikh, O V Plutalov, and Berlin YuA. Method of artificial DNA splicing by directed ligation (SDL). Nucleic Acids Res. 1991 Dec 25; 19(24): 6757–6761. doi: 10.1093/nar/19.24.6757 . PMCID: PMC329306 . PMID 1662363 .
↑ Clancy, Suzanne (2008). "RNA Splicing: Introns, Exons and Spliceosome". Nature Education 1 (1). Consultado o 31 de marzo de 2011.
↑ ^3,0 ^3,1 Black, Douglas L. (2003). "Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing". Annual Reviews of Biochemistry 72 (1): 291–336. PMID 12626338. doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161720.
↑ Matlin, AJ; Clark F, Smith, CWJ (maio de 2005). "Understanding alternative splicing: towards a cellular code". Nature Reviews 6 (5): 386–398. PMID 15956978. doi:10.1038/nrm1645.
↑ Patel AA, Steitz JA (2003). "Splicing double: insights from the second spliceosome". Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (12): 960–70. PMID 14685174. doi:10.1038/nrm1259.
↑ Yang Y, Walsh CE (2005). "Spliceosome-mediated RNA trans-splicing". Mol. Ther. 12 (6): 1006–12. PMID 16226059. doi:10.1016/j.ymthe.2005.09.006.
↑ Noren CJ, Wang J, Perler FB (2000). "Dissecting the chemistry of protein splicing and its applications". Angew Chem Int Ed Engl 39 (3): 450–66. PMID 10671234. doi:10.1002/(sici)1521-3773(20000204)39:3<450::aid-anie450>3.3.co;2-6.
↑ Hanada, Ken-ichi; Yang, James C. (2005-06). "Novel biochemistry: post-translational protein splicing and other lessons from the school of antigen processing". Journal of Molecular Medicine (en inglés) 83 (6): 420–428. ISSN 0946-2716. doi:10.1007/s00109-005-0652-6.

Véxase tamén

Outros artigos

[DNAsplicing-1] 1,0 ^1,1 E N Lebedenko, K R Birikh, O V Plutalov, and Berlin YuA. Method of artificial DNA splicing by directed ligation (SDL). Nucleic Acids Res. 1991 Dec 25; 19(24): 6757–6761. doi: 10.1093/nar/19.24.6757 . PMCID: PMC329306 . PMID 1662363 .

[2] Clancy, Suzanne (2008). "RNA Splicing: Introns, Exons and Spliceosome". Nature Education 1 (1). Consultado o 31 de marzo de 2011.

[Black-3] 3,0 ^3,1 Black, Douglas L. (2003). "Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing". Annual Reviews of Biochemistry 72 (1): 291–336. PMID 12626338. doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161720.

[Matlin-4] Matlin, AJ; Clark F, Smith, CWJ (maio de 2005). "Understanding alternative splicing: towards a cellular code". Nature Reviews 6 (5): 386–398. PMID 15956978. doi:10.1038/nrm1645.

[5] Patel AA, Steitz JA (2003). "Splicing double: insights from the second spliceosome". Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (12): 960–70. PMID 14685174. doi:10.1038/nrm1259.

[6] Yang Y, Walsh CE (2005). "Spliceosome-mediated RNA trans-splicing". Mol. Ther. 12 (6): 1006–12. PMID 16226059. doi:10.1016/j.ymthe.2005.09.006.

[7] Noren CJ, Wang J, Perler FB (2000). "Dissecting the chemistry of protein splicing and its applications". Angew Chem Int Ed Engl 39 (3): 450–66. PMID 10671234. doi:10.1002/(sici)1521-3773(20000204)39:3<450::aid-anie450>3.3.co;2-6.

[8] Hanada, Ken-ichi; Yang, James C. (2005-06). "Novel biochemistry: post-translational protein splicing and other lessons from the school of antigen processing". Journal of Molecular Medicine (en inglés) 83 (6): 420–428. ISSN 0946-2716. doi:10.1007/s00109-005-0652-6.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]