Barwienie metodą Grama

Różnicujące
	; Laseczki wąglika zabarwione metodą Grama (Gram +)
	Metoda
Zastosowanie	rozróżnianie bakterii pod względem budowy ściany komórkowej
Użyte odczynniki	roztwór fioletu krystalicznego, płyn Lugola, 90% etanol z dodatkiem acetonu, fuksyna karbolowa lub safranina
Metoda	Grama
	Zabarwienie wybranych struktur
	Multimedia w Wikimedia Commons

Metoda Grama – metoda barwienia bakterii. Pozwala doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie, także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki.

Schemat barwienia

na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę hodowli płynnej lub w przypadku hodowli stałej nanieść 1-2 krople soli fizjologicznej i wykonać rozmaz
szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalić (dzięki temu procesowi jest łatwiejsze wnikanie barwnika do wnętrza komórki):
- fizycznie: trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika;
- chemicznie: poprzez użycie np.: formaliny lub etanolu z domieszką eteru;
utrwalony preparat zalewać nad rynienką roztworem fioletu krystalicznego z dodatkiem 1-2% fenolu^[1]
odczekać 60 sekund do 3 minut^[1]
tryskawką delikatnie zmyć barwnik
zalać preparat jodyną lub płynem Lugola
odczekać 30 sekund do 2 minut^[1]
ostrożnie odbarwić całość w etanolu przez ok. 10-20 sekund
spłukać preparat wodą destylowaną
dobarwić innym barwnikiem, np. safraniną czy fuksyną zasadową przez ok. 30 sekund
dobrze spłukać preparat wodą destylowaną i po wyschnięciu oglądać pod mikroskopem

Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.
Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie fioletowe.
Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1–2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też, że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu (niedobór magnezu może powodować barwienie na czerwono bakterii zasadniczo Gram-dodatnich) i zasadowego białka, które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach^[1] lub bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet^[1].
Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są fioletowe, zaś Gram-ujemne – bezbarwne.
Dodatkowy barwnik (np. safranina lub fuksyna) barwi komórki Gram-ujemne na różowo lub czerwono, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

W efekcie wyżej przedstawionych działań i opisanego mechanizmu komórki efekty mogą być czworakie:

bakterie barwiące się na kolor ciemnofioletowy, prawie czarny, określa się jako Gram-dodatnie (Gram +)^[2]
bakterie odbarwiające się pod wpływem etanolu z koloru ciemnofioletowego na kolor różowy, określa się jako Gram-ujemne (Gram −)^[2]
bakterie niebarwiące się standardową metodą Grama^[2], np. prątki (są trudnobarwliwe – można je wybarwić poprzez wydłużenie czasu dla fioletu krystalicznego i płynu Lugola),
bakterie Gram-zmienne^[2], np. Gardnerella vaginalis.

Efekt barwienia zależy od podłoża i wieku hodowli:

starsze hodowle Clostridium mogą barwić się Gram-ujemnie (normalnie są one Gram-dodatnie)^[1]
kiełkujące przetrwalniki (i pierwsze pokolenie po wykiełkowaniu) Bacillus subtilis barwią się Gram-ujemnie (normalnie są one Gram-dodatnie)^[1]

↑ ^a ^b ^c ^d ^e ^f ^g JanuszJ. Wawrzkiewicz JanuszJ. (red.), Mikrobiologia weterynaryjna, Warszawa: Państwowe Wydawnictwo Naukowe, 1981, s. 41, ISBN 83-01-03727-X .
↑ ^a ^b ^c ^d The Gram Stain, [w:] Jacquelyn G.J.G. Black Jacquelyn G.J.G., LauraL. Black LauraL., Microbiology. Principles and explorations, wyd. 9, Hoboken, NJ 2015, s. 69, ISBN 978-1-118-74316-4, OCLC 890080205 .