垂直显像SMI
垂直显像SMI是1996年在SMI与SPDM的基础上开发出来的，能在奈米等级上最快分析完整的3D细胞结构的光学显微镜，有效的奈米级光学解析度，在解析2D图像能达到5 nm，而在解析3D图像能达到40 nm，所以比起以Abbe定律所算出来的物理极限200 nm还要更佳。[1] 恩斯特·阿贝在1873年提出理论上光学显微镜的解析度限制假说。
垂直显像SMI光学显微镜是由海德堡大学光学应用与资讯处理博士克里斯托夫克勒梅所开发出来，集结了定位光学显微镜(光学间距精密显微镜SPDM, Spectral Precision Distance Microscopy)结构照明设备(空间调整照明设备SMI, Spatially Modulated Illumination)的科技。
自从2008年3月起，许多标准的萤光染剂像是绿色荧光蛋白(GFP)与Alexa萤光染剂可以应用在SPDMphymod (可物理修饰萤光团physically modifiable fluorophores)定位光学显微镜上，这种显微镜只有单一雷射波长才有适合的光强度能用在奈米图解上。
配置
[编辑]SMI是特别的雷射光学照明设备 (空间调整照明设备Spatially Modulated Illumination)与用Vertico反射垂直向的光，使之能够分析固定住的标本细胞也能分析光学解析度在10奈米甚致更少的活细胞 (1奈米 = 1 nm = 1 × 10−9 m).
此项科技的特别之处与聚焦科技，例如4Pi显微镜相比，差在较宽视野能让整个细胞能在奈米等级的解析度下完整的描绘出来。这种整个细胞的3D显像技术在20 µm × 20 µm的范围下，只需花2分钟，宽视野的显像能让整个物体的照明与针测同时进行。
空间调整照明设备(SMI: Spatially Modulated Illumination)
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SMI 光学显微镜是建立在点扩散函数工程的光学处理技术之上，用以修正显微镜的点分散函数(PSF) 来增加光学解析度，使之能以波长等级来测量萤光物质的距离，分析其他结构参数则能达到奈米等级。
SMI显微镜在海德堡大学已经达到下列成果: 每个物件照明的强度都不一样，与传统的宽视野萤光显微镜不同，而是以两个相反方向的干涉雷射光来调整空间的精确性，这种空间上的调整波长原理是在1993 由Bailey et al发表。[2][3]
SMI可以与其他超解析科技结合，像是与3D LIMON或是LSI-TIRF侧向显像技术而成全内反射。SMI 科技能允许读出自动萤光基团(autofluorophore)分布在人类眼睛组织的光学图像，这使用了3种不同激发波长(488、568 、647 nm)而能收集自动萤光发出的光谱讯号，这项技术已经应用在人类眼睛组织的黄斑部退化上。[4]
定位显微镜(SPDM: Localization Microscopy)
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SPDM (光学间距精密显微镜Spectral Precision Distance Microscopy)，定位光学显微镜的基础是荧光显微镜加上光学处理使得能测量"光学上分离"粒子的位置、距离与角度(例如:分子)光学显微镜的解析限制之下。 "光学上分离"指的是在一定的时间之内的一点上, 只有单一粒子或是分子在特定的区域被传统的光学解析度下(大概是直径200-250 nm)侦测到。当所有的分子在某个区域都含有不同的光学标记就能实现(例如:不同的颜色或者不同粒子发射的不同激发光 )
使用SPDM能达到结构的解析且能侦测两点间空间上的最短距离，位置则由粒子的不同光学特性定位(拓墣解析)。在合适的条件下，则是依定位的精确度, 粒子密度等等决定，"拓墣解析"则是对应"频率偏移调变"。
SPDM 是一种定位显微镜能达到有效的光学解析较于传统的光学解析(大概200-250 nm)更佳，能显出有效点像函数的最大值的一半宽，借由应用合适的雷射光学精密处理技术，位置与距离小于点分散函数(传统上200-250 nm) 的一半宽，且能被侦测目标物与不同的光学讯号精确到奈米等级。[5] 其中一项重要的应用是在基因研究方面(研究基因组中有功能的部分)，另一项则是研究膜的构造。
定位光学显微镜的其中一个里程碑是1996年第一次在3D奈米等级上定位萤光物质，[6]也因此从理论上与实验上证明定位的精确度。[7][8]
SPDMphymod: GFP快门模式标准萤光染剂(Standard fluorescent dyes in the blinking mode like GFP)
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在过去两年有分子应用在奈米显微研究，此分子能射出一样光谱频率的光(但在光学的闪光特性上则不同)且能像光学间距精密显微镜一样借由光来调控能否射出光。能借由结合上千张相同细胞的影像且使用雷射光谱精密测量来记录定位的影像达到改善光学解析度。应用这种特别的奈米显微处理技术在过去是非常困难的，因为过去以为只有特殊制造的分子才能使用光来调控能否射出光。
在2008年3月，克里斯托夫克勒梅的实验室发现在某种光学-物理条件下也可以使用许多标准萤光染剂GFP、Alexa染剂与萤光素分子，使用SPDMphymod (可物理修饰萤光团physically modifiable fluorophores)技术，在适合的光强度下，单一雷射则可以显出奈米级的影像。与其他需要两条雷射的定位显微镜不同，使用特别的光-调控/光-活化萤光分子。[9]
GFP基因很早就被引进而且表现在许多原核与真核生物中，由于他们发现与开发GFP ，诺贝尔化学奖在2008年颁发给马丁·查尔菲、下村脩与 钱永健。标准萤光分子除了能应用在SPMD上，还能应用在许多其他的领域上像是生物物理学, 细胞生物学与医学等等。
SPDMphymod科技已经能使用标准萤光染剂:GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488与萤光素。
奈米等级光学显微镜(LIMON): 3D超解析显微镜
[编辑]奈米等级光学显微镜(LIMON Light MicrOscopical nanosizing microscopy) 在2001年海德堡大学发明，同时结合定位显微镜与空间调整照明设备在3D超解析显微镜上。
结合SMI与SPDM使垂直显像SMI能绘出3D图像，因此第一次SMI计画与SPDM计画始动。SMI计画决定粒子的中心与粒子的在显微镜轴的分散方向。然而粒子或分子的中心可以精确到1-2 nm，分散离中心的程度可以被由轴直径精确到30-40 nm。
随后，侧向粒子或分子则采用SPDM来定位且能精确到奈米等级。SPDM能达到每秒16桢与有效的2D解析度精确到10 nm ;大概每2000桢能与SMI资料结合(所需时间大约10秒)而产生高解析度的三维影像(有效的3D光学解析度大概在40-50 nm左右)。而使用快速照相机有些甚至能有较快的速率(达到每秒数百桢)。而使用合适的染剂能产生较好的3D解析影像。[10]
应用SPDMphymod结合SMI (两者都在1996年由克里斯托夫克勒梅的实验室所发明) 利用3D双重颜色重建Her2/neu与 Her3的排列模式，这些蛋白团能被定位精确到25 nm。[11]
工业上使用超解析显微镜
[编辑]超解析显微技术既能使用在生医实验室还能应用在制药研究上，在辨识与判断目标物的价值上特别有用，例如: 生物分子装置(BBM biomolecular machines) 都是由许多胜任基本功能的体细胞大分子所组成高度奈米结构的复合物，依功能而决定特定的结构，BBM的其中一个例子是拟核区，它让两公尺长的DNA折叠在直径只有几微米的区域，因此DNA 才能在细胞中扮演讯息与调控的中心脚色。
借由使用LIMON 3D结合LIMON复合物标定，使第一次做3D复合物如BMM的隐密蛋白质或核酸能显像且不破坏其结构。直到现今，最大的问题是在详细分析内部大分子时必须破坏复合物的构造，所以有些利用电脑模型或者以核磁共振方式来模拟复合物的三维结构。[12]
相关文献
[编辑]- ^ Reymann, J; Baddeley, D; Gunkel, M; Lemmer, P; Stadter, W; Jegou, T; Rippe, K; Cremer, C; Birk, U. High-precision structural analysis of subnuclear complexes in fixed and live cells via spatially modulated illumination (SMI) microscopy. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 2008, 16 (3): 367–82. PMID 18461478. doi:10.1007/s10577-008-1238-2.
- ^ R. Heintzmann, C. Cremer (1999) Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568: 185-196
- ^ US patent 7,342,717: Christoph Cremer, Michael Hausmann, Joachim Bradl, Bernhard Schneider Wave field microscope with detection point spread function, priority date 10th july 1997
- ^ Best G, Amberger R, Baddeley D, Ach T, Dithmar S, Heintzmann R and Cremer C (2011). Structured illumination microscopy of autofluorescent aggregations in human tissue. Micron, 42, 330-335
- ^ Lemmer P, Gunkel M, Baddeley D, Kaufmann R, Urich A, Weiland Y, Reymann J, Müller P, Hausmann M, Cremer C (2007): SPDM – Light Microscopy with Single Molecule Resolution at the Nanoscale. In: Applied Physics B 2008; 93: 1–12
- ^ J. Bradl, B. Rinke, A. Esa, P. Edelmann, H. Krieger, B. Schneider, M. Hausmann, C. Cremer (1996): Comparative study of three-dimensional localization accuracy in conventional, confocal laser scanning and axialtomographic fluorescence light microscopy. Proc. SPIE 2926: 201-206
- ^ R. Heintzmann, H. Münch, C. Cremer (1997) High-precision measurements in epifluorescent microscopy - simulation and experiment. Cell Vision 4: 252-253
- ^ US patent 6,424,421: Christoph Cremer, Michael Hausmann, Joachim Bradl, Bernd Rinke Method and devices for measuring distances between object structures, priority date 23rd december 1996
- ^ Manuel Gunkel, Fabian Erdel, Karsten Rippe, Paul Lemmer, Rainer Kaufmann, Christoph Hörmann, Roman Amberger and Christoph Cremer (2009): Dual color localization microscopy of cellular nanostructures. In: Biotechnology Journal, 2009, 4, 927-938. ISSN 1860-6768
- ^ Baddeley D, Batram C, Weiland Y, Cremer C, Birk UJ.: Nanostructure analysis using Spatially Modulated Illumination microscopy. In: Nature Protocols 2007; 2: 2640–2646
- ^ Rainer Kaufmann, Patrick Müller, Georg Hildenbrand, Michael Hausmann & Christoph Cremer (2010): Analysis of Her2/neu membrane protein clusters in different types of breast cancer cells using localization microscopy, Journal of Microscopy 2010, doi:10.1111/j.1365-2818.2010.03436.x
- ^ Super Resolution Microscopy for Pharmaceutical Industry: Patents granted for 3D complex labeling. [2013-07-01]. （原始内容存档于2012-01-09）.
相关连结
[编辑]- GFP Superresolution
- Publication list optical nanoscopy（页面存档备份，存于互联网档案馆）
- press release of the University of Heidelberg（页面存档备份，存于互联网档案馆）
- Superresolution Measurements Laser Optical Nanoscopy
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